通常如果出现非特异会首先尝试以下方法:
降低引物和聚合酶的用量,提高退火温度,或者是采用梯度PCR法,测试能够获得最佳结果的温度退火。
如果还是不行,就试试touchdown方法,退火温度从高到低,每隔一个反应温度下降1C或者怎么样的,这样可以便于扩增出特异性更好的条带。
当然,如果模板可以纯化一下,或者重新制备,也可以避免有非特异物质或者是降解的片段干扰。
总体来说,先优化。实在不行需要重新设计引物,并且将引物序列在NCBI里面和你的样品的基因组做一下比对,看看什么位置有可能造成非特异结合。
你是不是引物没稀释,下面那个应该是引物二聚体